BAB I
PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang
Kimia analisis melibatkan penggunaan sejumlah teknik dan metode
untuk memperoleh aspek kualitatif, kuantitatif, dan informasi struktur dari
suatu senyawa atau bahan kimia. Kebanyakan bahan-bahan di alam terdapat dalam
bentuk senyawa yang beraneka ragam . dan untuk mendapatkan senyawa yang
diinginkan maka harus dilakukan pemisahan pada senyawa campuran tersebut. Untuk
memisahkan suatu senyawa dari senyawa campurannya dan memperoleh senyawa murni,
maka dipakai metode pemisahan dalam analisis.
Metode pemisahan merupakan salah satu metode analisis yang
merupakan aspek penting dalam bidang kimia. Berbagai teknik pemisahan dapat
diterapkan untuk memisahkan campuran. Salah satu metode pemisahan yaitu
kromatografi. Kromatografi merupakan metode pemisahan fisik, dimana
komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan di antara dua fase yaitu fase
diam dan fase gerak.
Salah satu jenis kromatografi konvensional adalah kromatografi
lapis tipis (KLT) . media pemisahan dalam kromatografi ini adalah lapisan
dengan ketebalan 0,1-0,3 mm zat adsorben pada lempeng kaca, plastik, atau
aluminium. Kromatografi merupakan metode pemisahan yang sering dilakukan karena
murah dan mudah dilakukan serta pelaksanaanya tidak membutuhkan waktu yang
lama. Untuk mengetahui lebih jauh tentang kromatografi lapis tipis (KLT), maka
disusun makalah yang berjudul Kromatografi Lapis Tipis ini dengan harapan bisa menambah
pemahaman kita terhadap metode pemisahan dengan menggunakan Kromatografi Lapis
Tipis.
1.2
Rumusan Masalah
Rumusan
masalah dari makalah ini adalah sebagai berikut:
a)
Apa yang pengertian dan prinsip kerja dari Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ?
b)
Apa
fase diam dan fase gerak pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ?
c)
Bagaimana
pelaksanaan dan proses pemisahan pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ?
d)
Apa
saja variasi prosedur pada KLT?
e)
Bagaimana
penggunaan KLT dalam analisis kualitatif, kuantitatif, dan preparatif ?
1.3
Tujuan
a)
Untuk
mengetahui pengertian dan prinsip kerja dari Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
b)
Untuk
mengetahui fase diam dan fase gerak pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
c)
Untuk
mengetahui pelaksanaan dan proses pemisahan pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
d)
Untuk
mengetahui variasi prosedur pada KLT.
e) Untuk mengetahui penggunaan KLT dalam analisis kualitatif, kuantitatif, dan preparatif.
BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Pengertian dan Prinsip
Kerja Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan
Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain
kromatografi kertas dan elektroforesis. Berbeda dengan kromatografi kolom yang
mana fase diamnya diisikan atau dikemas di dalamnya, pada kromatografi lapis
tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang
datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium atau pelat plastik.
Meskipun demikian, kromatografi planar ini dapat dikatakan sebagai bentuk
terbuka dari kromatografi kolom.
Kromatografi
lapis-tipis merupakan
salah satu kromatografi yang berdasarkan adsorpsi, tahapan analisis dengan
kromatografi lapis tipis sama seperti pada kromatografi kertas. Kelebihan
kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas adalah waktu
elusi yang relative lebih pendek dan dapat digunakan untuk analisis
kuantitatif.
Kromatografi Lapis Tipis merupakan teknik pemisahan yang
adsorbennya dilapiskan pada lempeng kaca yang bersifat sebagai penunjang fasa
diam dan terbentuk kromatogram. Ini dikenal juga sebagai kromatogram dengan
kromatografi kolom terbuka. Metode ini sedrhana, cepat dalam pemisahan dan
sensitif, kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali
senyawa-senyawa yang terpisahkan.
Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran
antara sampel dengan pelarut yang
digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin
dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen
maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang bersifat
hidrofobik seperti lipida-lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan
kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk
kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom,
identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala
kecil.
Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, aatu
kombinasi cairan padatan0 dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak
mengalir melalui fase diam yang membawa komponen-komponen yang terdapat dalam
campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda.
2.2 Fase Diam
dan Fase Gerak pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Fase Diam KLT
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran
kecil dengan diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam,
maka semakin baiok kinerja KLT dalam hal efisiensinya dan resolusinya.
Penjerap yang paling sering digunakan silika dan serbuk selulosa,
sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorpsi.
Lapisan tipis yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin
penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang digunakan untuk pemisahan
kiral.
Pelaksaanan
kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina
yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel
silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis
tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour
dalam sinar ultra violet.Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut
yang sesuai. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah
alumina-aluminiumoksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH.
Apa yang kita sebutkan tentang jel silika kemudian digunakan serupa untuk
alumina.
Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom
silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun,
pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.Jadi, pada
permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Permukaan jel
silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen
dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van
der Waals dan atraksi dipol-dipol.. Fase diam lainnya yang biasa digunakan
adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki
gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel silika kemudian digunakan serupa
untuk alumina.
Berikut merupakan ringkasan beberapa penjerap (fasa diam) yang
sering digunakan dalam KLT beserta mekanisme pemisahannya, serta penggunaannya
untuk analisis.
Tabel 1. Beberapa penjerap fase diam yang digunakan pada KLT
|
Penjerap |
Mekanisme
Sorpsi |
Penggunaan |
|
Silika gel |
Adsorpsi |
Asam amino,
hidrokarbon, vitamin, alkaloid. |
|
Silika yang
dimodifikasi dengan hidrokarbon |
Partisi
termodifikasi |
Senyawa-senyawa
non polar |
|
Serbuk
selulosa |
Partisi |
Asam amino,
nukleotida, karbohidrat |
|
Alumina |
Adsorpsi |
Hidrokarbon,
ion logam, pewarna makanan, alkaloid. |
|
Kieselguhr
(tanah diatomae) |
Partisi |
Gula,
asam-asam lemak |
|
Selulosa
penukar ion |
Pertukaran
ion |
Asam nukleat,
nukleotida, halida dan ion-ion logam |
|
Gel Sephadex |
eksklusi |
Polimer,
protein, kompleks logam |
|
ᵝ-siklodekstrin |
Interaksi
adsorpsi stereospesifik |
Campuran
enasiomer |
Lempeng KLT disiapkan dengan melapiskan penjerap ke permukaan
lapisan kaca, gelas, atau aluminium dengan ketebalan 250μm. Lempeng KLT telah
tersedia di pasaran dengan berbagai ukuran
dan telah ditambah dengan fluorensen untuk memfasilitasi deteksi bercak
solut .
Modifikasi Fase Diam
Untuk tujuan tertentu, silika gel atau fase diam yang lain dapat
dimodifikasi dengan cara pembaceman.
Berikut akan diuraikan beberapa perlakuan terhadap pejerap:
1.
Perlakuan silika dengan KOH
Untuk analisis senyawa-senyawa yang bersifat basa dapat dilakukan
dengan menggunakan fase diam silika yang disemprot dengan larutan KOH dalam
metanol. Perlakuan ini bertujuan untuk memperoleh kromatogram senyawa dalam
bentuk basa bebasnya daripada dalam bentuk garamnya. Garam-garam amina akan
bergerak sangat lambat dalam fase gerak pelarut organik karena senyawa-senyawa
basa hanya cenderung berinteraksi secara kuat dengan gugus silanol yang ada di
fase diam; karenanya jika ada KOH dalam fase diamnya akan menekan interaksi
ini.
Fase gerak yang digunakan untuk jenis ini biasanya juga mengandung
suatu komponen yang bersifat basa. Contoh fase gerak yang digunakan untuk
senyawa-senyawa yang bersifat basa menggunakan fase diam silika gel yang
dibacem dengan KOH adalah:
1.
Larutan
metanol/amonia (100:1,5)
2.
Sikloheksana
/ toluena/ dietilamina (75:10:15)
3.
Kloroform:metanol
(90:10)
Senyawa 2 bersifat agak nonpolar dan berguna untuk memisahkan senyawa-senyawa basa yang sangan hipofilik seperti basa-basa anthistamin, narkotika, dan simpatomimetika.
2.
Pembaceman silika gel
Permukaan slika gel dapat dibuat nonpolar dengan mereaksikannya dengan cara pembaceman menggunakan diklorodimetilisina. Sejumlah reagen silanisasi dapat digunakan pada reaksi ini, seperti oktadesilina(ODS) yang akan menghasilkan lempeng silika gel ODS yang serupa dengan kolom ODS dalam KCKT . selain itu , silika gel juga dapat dibacem dengan parafin cair, minyak silikon atau dengan lemak. Lempeng fase diam yang dibacem dengan pereaksi ini digunakan untuk identifikasi hormon-hormon steroid.
3.
Keiselguhr sebagai pendukung lembam (inert)
Keiselguhr sendiri tidak mempunyai sifat absortif yang kuat tetapi
Keiselguhr dapat dilapiskan pada fase diam cair berlilin. Keiselguhr yang
dilapiskan dengan cairan parafin digunakan dalam uji farmakope untuk
trigleserida dan asam-asam lemak dalam minya (fixed oil). Lempeng Keiselguhr
dibacem dengan larutan yang mengandung cairan parafin dalam petroleum eter.
Dengan demikian lempeng Keiselguhr mempunyai permukaan hidrofobik. Sampel fix
oil yang diuji ditotolkan dalam lempeng lempeng, dan lempeng dikembangkan dengan asam asetat sebagai fase
gerak.
Asam asetat merupakan pelarut yang sangat polar sehingga lapisan
parafin tidak akan terlarut ke dalamnya. Sebaliknya trigliserida dalam fixed
oil hanya bersifat sedikit polar karenanya akan terpartisi dalam lapisan
parafin cair dan fase gerak (asam asetat). Semakin panjang rantai asam lemak
dalam trigeliserida, semakin rendah nilai Rf- nya. Lempeng
selanjutnya diamati dengan menggunakan
uap iodium dan dilanjutkan dengan penyemprotan secara permanen denganlarutan
pati.
Reagen lain yang digunakan untuk membacem Keiselguhr adalah:
formamida dan propan-1,2-diol. Dalam kasus digunakannya agen pembacem ini maka fase gerak yang
digunakan harusv mempunyai polaritas yang rendah untuk menghindari terlarutnya
agen dari lempeng fase diam.
Fase Gerak pada KLT
Dalam kromatografi, eluent adalah
fasa gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed)
untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan
eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh
sebab itu pemisahan komponen gula dalam tetes secara kromatografi dipengaruhi
oleh laju alir eluent dan jumlah umpan.
Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut
atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak
digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika.
Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut. Suatu pelarut yang
bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak
polar dari ikatannya dengan alumina (jel silika). (Kantasubrata, 1993).
Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan itu
tergantung pada:
a.
Bagaimana
kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada bagaimana besar
atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
b.
Bagaimana
senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Hal ini tergantung pada bagaimana
besar atraksi antara senyawa dengan jel silika.
Faktor-faktor yang mempengaruhi
gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga Rf
adalah :
1) Struktur kimia dari senyawa yang
sedang dipisahkan.
2) Sifat dari penyerap dan derajat
aktifitasnya.(Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini
akan mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari
penyerap). Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap
harga Rf meskipun menggunakan fasa bergerak dan solute yang
sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama, jika
menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap dan jika pengikat
(kalau ada) dicampur hingga homogen.
3) Tebal dan kerataan dari lapisan
penyerap, dalam prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya,
tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan
aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.
4) Pelarut (dan derajat kemurniannya)
fasa bergerak. Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fasa bergerak
dalam kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran
pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul
diperhatikan.
5) Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana
pengembangan yang digunakan.
6) Teknik percobaan.
Arah pelarut bergerak di atas
plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena cara ini yang
paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan).
7) Jumlah cuplikan yang digunakan.
Penetesan cuplikan dalam jumlah
yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya
ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan
pada harga-harga Rf.
8) Suhu. Pemisahan-pemisahan
sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk mencegah
perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau
perubahan-perubahan fasa.
9) Kesetimbangan.
Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalarn kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fasa bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.
Anggaplah bercak awal pada alumina
mengandung dua senyawa, yang satu dapat membentuk ikatan hidrogen, dan yang
lainnya hanya dapat mengambil tiap-tiap bagian interaksi van der Waals yang
lemah. Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel
silika lebih kuat dibanding senyawa lainnya. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap
lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan
suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan.
Penjerapan bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut. Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan menjerap lebih kuat daripada yang tergantung hanya pada interaksi van der Waals, dan karenanya bergerak lebih jauh pada lempengan.
Dalam
kromatografi, eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi
bagi larutan untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi antara fase diam
dengan eluent sangat menetukan terjadinya pemisahan komponen-komponen dalam
sampel.
Fase
gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan
mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling
sedrhana adalah campuran dua pelarut organik karena daya elusi campuran kedua
pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi
secara optimal.
Berikut adalah petunjuk dalam memilih dan mengoptimalisasi fase gerak:
- Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif.
- Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan
- Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut yang sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan asam.
- Untuk pemisahan yang menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat polar seperti dietil eter ke dalam pelarut nonpolar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan. Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat dibanding senyawa lainnya hanya dapat mengambil bagian interaksi van der Waals yang lemah. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan. Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari permukaan silika. Penyerapan pada kromatografi lapis tipis bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut. Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa sesnyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.
2.3 Pelaksanan dan Proses Pemisahan pada Kromatografi Lapis Tipis
a. Penotolan Sampel
Sebelum
sampel ditotolkan, sebuah garis menggunakan pensil digambar didekat bagian bawah lempengan . Diberikan
penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari sampel.
Pemisahan
pada KLT yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran
bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi
yang lain, jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan
resolusi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penotolan sampel secara otomatis
lebih dipilih daripada penotolan secara manual terutama jika sampel yang kan
ditotolkan lebih dari 15μm. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan
bercak yang menyebar dan puncak ganda.
Berdasarkan
pada tujuan analisis, berbagai macam jumlah sampel telah disarankan untuk
digunakan dan diringkas pada tabel berikut.
Tabel 2.
Parameter-parameter aplikasi yang direkomendasikan
|
Tujuan
|
Diameter bercak (mm) |
Konsentrasi sampel (%) |
Banyaknya sampel (μg) |
|
densitometri |
2 mm untuk volume sampel 0,5 μl |
0,02-0,2 |
0,1-1 (untuk KLT- KT) 1-10 (konvensional) |
|
identifikasi |
3mm untuk volume sampel 1 μl |
0,1-1 |
1-20 |
|
Uji kemurnian |
4 mm untuk volume sampel 2μl |
5 |
100 |
Untuk memperoleh reprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5μl. Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10μl maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totol.
b. Pengembangan
Bila
sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel
tersebut dalam suatu bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan
uap fase gerak. Tapi bagian bawah lempeng lapis tipis yang telah ditotoli
sampel dicelupkan ke dalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak
dalam bejana harus di bawah lempeng yang telah berisi totolan sampel.
Bejana
kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak sedikit
mungkin (akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng
yang telah ditentukan). Untuk melakukan penjenuhan fase gerak , biasanya bejana
dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah mencapai ujung atas kertas
saring , amaka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh. Selama proses
elusi, bejana kromatografi harus ditutup rapat, misalkan dengan lembar
aluminium dan sebagainya.
Ada
beberapa teknik untuk melakukan teknik pengembangan dalam KLT, yaitu:
a.
Pengembangan
menaik (ascending)
b.
Pengembangan
menurun (descending)
c.
Melingkar
d.
Mendatar
Meskipun demikian, cara menaik (ascendin) merupakan cara yang paling popular dibandingkan dengan cara lain.
c. Deteksi bercak
Bercak
pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Untuk
penentuannya dapat dilakukan secara fisika, kimia, maupun biologi. Cara kimia
yang biasa dilakukan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi
melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat
digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan pencacahan radioaktif dan
fluorosensi sinar ultra violet. Fluoresensi sinar ultraviolet terutama
dilakukan untuk senyawa yang berfloresensi, membuat bercak akan terlihat jelas.
Jika senyawa tidak dapat berfloresensi maka bahan penyerapnya akan diberi
indikator yang bisa berfluoresensi. Dengan demikian bercak akan kelihatan
hitam. Sedang latar belakangnya akan kelihatan berfluoresensi.
Berikut
adalah cara-cara kimia untuk mendeteksi bercak:
a.
Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang
akan bereaksi secara kimia dengan seluruh solut yang mengandung gugus
fungsional tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang-kadng lempeng
dipanaskan terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan
intensitas warna bercak.
b.
Mengamati
lempeng di bawah lampu ultraviolet yang
dipasang pada panjang gelombang emisi 254 atau 366 untuk menampakkan solut
sebagai bercak yang gelap atau bercak yang berfluoresensi terang pada dasar yang berfluoresensi seragam.
Lempeng yang diperdagangkan dapat dibeli dalam bentuk lempeng yang sudah diberi
dengan senyawa fluoresens yang tidak larut yang dimasukkan ke dalam fase diam
untuk memberikan dasar fluoresensi atau dapat pula dengan menyemprot lempeng
dengan reagen fluoresensi setelah dilakukan pengembangan.
c.
Menyemprot
lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu dipanaskan untuk
mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak sebagai bercak hitam sampai
kecoklat-coklatan.
d.
Memaparkan
lempeng dengan uap iodium dalam Chamber tertutup
e.
Melakukan
scanning pada permukaan lempeng dengan
densitometer, suatu instrumen yang dapat mengukur intensitas radiasi yang
direfleksikan dari permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu
sinar tampak. Solut-solut yang mampu menyerap sinar akan dicatat sebagai puncak
(peak) dalam pencatat (recorder).
Reagen yang digunakan sebagai penampak bercak dalam KLT dapat
dibedakan menjadi 2, yaitu reagen umum (yang berlaku untuk hampir semua senyawa
organik) dan reagen selektif yang hanya
mendeteksi jenis atau golongan tertentu sebagaimana ditunjukkan dalam tabel
berikut:
Tabel 3. Beberapa reagen umum yang digunakan pada KLT
|
Metode
deteksi |
Warna bercak
solut |
Penggunaan |
|
Asam
fosfomolibdat+ pemanasan |
Biru gelap |
Beberapa
senyawa organik |
|
Asam sulfat pekat+ pemanasan |
Hitam
kecoklatan |
Semua senyawa
organik |
|
Uap Iodium |
Coklat |
Beberapa
senyawa organik |
Tabel 4. Beberapa reagen spesifik yang digunakan pada KLT
|
Metode
deteksi |
Warna bercak
solut |
Penggunaan |
|
Ninhidrin |
Pink ke ungu |
Asam-asam
amino dan amina |
|
2,4-dinitrofenil
hidrazon |
Oranye /
merah |
Senyawa-senyawa
karbonil |
|
Bromokresol
hijau/biru |
Kuning |
Asam-asam
organik |
|
2,7-fluoresein |
Kuning-kehijauan |
Senyawa
organik |
|
Vanilin/asam
sulfat |
Merah/hijau/pink |
Alkohol,
keton |
|
Rhodamin B |
Berfluoresensi
merah |
Lemak |
|
Anisaldehid/antimon
triklorida |
Berbagai
macam |
Steroid |
|
Difenil amin/
seng |
Berbagai
macam |
Pestisida |
c.
Menghitung Nilai Rf
Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran diukur nilai Rf nya. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing. Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.
Nilai Rf untuk setiap
warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Adanya variasi dalam prosedur pengembangan KLT serta adanya
fase-fase diam yang telah dikembangkan bertujuan untuk meningkatkan resolusi,
sensitivitas, kecepatan, dan selektifitasnya. Ada beberapa variasi prosedur KLT
yaitu:
1.
KLT
2 arah atau KLT 2 dimensi
KLT 2 arah atau
2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika
komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama,
karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana asam-asam amino.
Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara
berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan
pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda.
Sampel ditotolkan pada lempeng lalu dikembangkan dengan satu sistem
fase gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salah
sat sisi. Lempeng diangkat , dikeringkan, diputar 90°, dan diletakkan ke dalam
bejana kromatografi yang berisi sistem fase gerak yang kedua, sehingga bercak
yang terpisah pada pengembangan pertama terletak di bagian bawah sepanjang
lempeng, lalu dikromatografi lagi. Komponen yang terpisah dapat terdapat di
mana saja di dalam lempeng.
Kadang-kadang sering dijumpai senyawa yang terurai pada lapisan
tipis yang dapat disebabkan oleh kerja katalitis fase diam atau karena adanya
air yang terserap ke permukaan penjerap,
atau karena pengaruh udara. Adanya kemungkinan peruraian ini dapat diperiksa
dengan KLT 2 arah ini, jika digunakan sistem fase gerak yang sama. Jika tidak
terjadi peruraian, maka semua bercak akan terdapat dalam satu garis yang
memotong titik awal sampel. Jika ada peruraian , maka akan ada bercak diluar
garis.
2.
Pengembangan
Kontinyu
Pengembangan kontinyu (pengembangan terus-menerus) dilakukan dengan
cara mengalirkan fase gerak secara terus menerus pada lempeng KLT melalui suatu
wadah (biasanya alas tangki) melalui suatu lapisan dan dibuang dengan cara
tertentu pada ujung lapisan
3.
Pengembangan
Gradien
Pengembangan ini dilakukan dengan menggunakan komposisi fase gerak
yang berbeda-beda. Lempeng yang berisi
analit dapat dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang berisi fase
gerak tertentu lalu komponen fase gerak selanjutnya ditambahkan sedikit demi
sedikit ke dalam bejana dan diaduk sampai homogen.
Tujuan
utama sistem ini adalah mengubah polaritas
fase gerak. Meskipun demikian untuk memperoleh komposisi fase gerak yang
reprodusibel sangatlah sulit sehingga teknik kromatografi ini kurang begitu
populer.
2.5 Macam-Macam KLT
a. KLT Analitik
b. KLT Prepratif
Salah
satu metode pemisahan yang memerlukan biaya paling murah dan memakai peralatan
sedarhana ialah KLT preparatif. Walaupun KLT preparatif dapat memisahkan dalam
jumlah gram, sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah miligram. KLT
preparatif dilakukan dengan menggunakan lapisan tebal (sampai 1 mm) sebagai
pengganti lapisan penyerap yang tipis (0,10-0,25 mm). pita-pita sampel yang
sudah dipisah dapat diperoleh kembali dengan cara mengerok penyerap dari plat
KLT preparatif yang telah dikembangkan. Demikian kuatnya lapisan penyerap
melekat pada kaca penyokong sehingga memungkinkan pengembangan plat
berulang-ulang dengan pengembang yang sama atau pengembang yang berbeda, dengan
terlebih dulu mngeringkan plat sebelum pengembangan berikutnya (Harborne, 1987).
Fase
diam yang paling sering digunakan biasanya dengan ketebalan 0,5-2 mm dan ukuran
plat kromatogram biasanya 20x20 cm. fase diam yang paling umum dipakai ialah
silika gel dan dipakai untuk pemisahan berbagai campuran senyawa lipofil maupun
senyawa hidrofil.
Sampel
dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada plat KLT preparatif.
Pelarut yang baik ialah pelarut yang mudah menguap (atsiri), karena jika
pelarut kurang atsiri terjadi pelebaran pita. Konsentrasi sampel harus sekitar
5-10%. Sampel ditotolkan berupa pita yang harus ditotolkan sesempit mungkin
karena pemisahan tergantung pada lebar pita. Pemilihan pelarut ditentukan
berdasarkan pemeriksaan pendahuluan memakai KLT analitik. Karena ukuran
partikel penyerap kira-kira sama, pelarut yang dipakai pada KLT analitik dapat
dipakai pada KLT preparatif.
Pengembangan plat KLT preparatif biasanya dilakukan dalam bejana
kaca yang dapat menampung beberapa plat. Bejana dijaga tetap jenuh dengan
pelarut pengembang dengan bantuan sehelai kertas saring yang tecelup ke dalam
larutan pengembang. Keefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara
pengembangan berulang. Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak
dengan penyerap maka semakin besar kemungkinan penguraian (Hostettmann, 1995).
2.6 Penggunaan Kromatografi Lapis Tipis
KLT digunakan secara luas untuk analisis solut-solut organik
terutama dalam bidang biokimia, farmasi, klinis, forensik, baik untuk analisis
kualitatif dengan cara membandingkan Rf solut denga Rf senyawa baku atau untuk
analisis kuantitatif.
Penggunaan umum KLT adalah untuk menentukan banyaknya komponen
dalam campuran, identifikasi senyawa, identifikasi senyawa, memantau
berjalannya suatu reaksi, menentukan efektifitas pemurnian, menentukam kondisi
yang sesuai untuk kromatografi kolom, serta untuk memantau kromatografi kolom,
melakukan screening sampel untuk obat.
1.
Analisis
Kualitatif
KLT dapat digunakan untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter
pada KLT yang digunakan adalah nilai Rf. Dua senyawa dikatakan identik jika
mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama.
Untuk meyakinkan identifikasi dapat dilakukan dengan menggunakan
lebih dari 1 fase gerak dab jenis pereaksi semprot. Teknik spiking dengan
menggunakan senyawa baku yang sudah diketahui sangat dianjurkan untuk lebih
memantapkan pengambilan keputusan identifikasi senyawa.
2.
Analisis
Kuantitatif
Ada 2 cara yang digunakan untuk analisis kuantitatif dengan KLT. Pertama, bercak diukur langsung
pada lempeng dengan menggunakan ukuran luas atau dengan teknik densitometri.
Cara kedua adalah dengan mengerok bercak
lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam bercak tersebut dengan
metode analisis lain, misalkan dengan spektrofotometri. Pada cara pertama tidak
terjadi kesalahan yang disebabkan oleh perpindahan bercak atau kesalahan
ektraksi, sementara pada cara kedua sangat mungkin terjadi kesalahan karena
pengambilan atau karena ekstraksi.
Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah dipisahkan
dengan KLT biasanya dilakukan dengan densitometer langsung pada lempeng KLT (
atau secara in situ ). Densitometer dapat bekerja secara serapan atau
fluoresensi. Kebanyakan densitometer mempunyai sumber cahaya, monokromator
untuk memilih panjang gelombang yang cocok, sistem untuk memfokuskan sinar pada
lempeng, pengganda foton, dan recorder.
Pada sistem serapan dapat dilakukan dengan model pantulan atau
transmisi. Pada cara pantulan, yang diukur adalah sinar yang dipantulkan, yang
dapat menggunakan sinar tampak maupun ultraviolet. Sementara itu, cara transmisi dilakukan dengan menyinari bercak
dari satu sisi dan mengukur sinar yang diteruskan pada sisi lain. Pada
kenyataannya, hanya sinar tampak yang dapat digunakan untuk metode ini.
Gangguan utama pada sistem serapan adalah fluktuasi latar belakang(background)
yang dapat dikurangi dengan beberapa cara, misalnya dengan menggunakan alat
berkas ganda, sisem transmisi dan pantulan secara bersamaan, atau dengan sistem
dua panjang gelombang.
Kurva baku dibuat untuk setiap lempeng dan kadar senyawa dihitung
seperti pada metode instrumental yang lain. Presisi penetapan termasuk
penotolan cuplikan, pengembangan kromatogram, dan pengukuran adalah 2-5%.
Sistem fluoresensi biasanya lebih disenangi jika senyawa itu dapat
dibuat berfluoresensi. Batas deteksi sistem ini lebih rendah dan kelinieran
respon dan selektifitasnya lebih tinggi. Gangguan fluktuasi latar belakang juga
lebih rendah.
Bercak yang diukur dengan sistem fluoresensi, serapan ultraviolet,
atau sinar tampak dapat ditetapkan lebih teliti daripada bercak yang disemprot
dengan pereaksi warna. Faktor keseragaman pada penyemprotan merupakan hal yang
sangat menentukan.
Semua pekerjaan KLT jika ditujukan untuk analisis kuantitatif harus
dilakukan dengan seksama. Alat yang digunakan untuk mengambil sampel harus
terkalibrasi dengan baik. Saat ini tersedia alat penoto sampel kapiler yang
berukuran antara 1 sampai 100μL. Pada saat penotolan sampel, kapiler harus
tegak lurus dengan lempeng dan semua sampel harus dikeluarkan dari kapiler.
Analisis Kuntitatif dapat dilakukan dengan melarutkan kembali ion
atau senyawa yang sudah terpisahakan kemudian ditentukan serapannya. Dalam hal
ini cuplikan ion logam yang bersifat polar sehingga dapat dipisahkan
menggunakan kromatografi lapis tipis ini. Fase gerak yang biasa digunakan dalam
suasana basa Ni(II) dapat bereaksi dengan dimetil glioksim(DMG) membentuk warna
merah. Secara kualitatif warna merah dari kompleks Ni dapat ditentukan dengan spektrofotometri
sinar tampak.
3.
Analisis
Preparatif
Analisis preparatif ditujukan untuk memisahkan analit dalam jumlah
yang banyak lalu senyawa yang dipisahkan ini dianalisis lebih lanjut, misalkan
dengan spektrofotometri atau dengan teknik kromatografi lain.
Pada
KLT preparatif ini, sampel ditotolkan dalam lempeng dengan lapisan yang besar
lau dikembangkan dan dideteksi dengan cara yang non-destruktif. Bercak yang
mengandung analit yang dituju selanjutnya dikerik dan dilakukan analisis lebih
lanjut.
2.7 Contoh Aplikasi Penggunaan KLT
n Aplikasi KLT dapat digunakan untuk memisahkan tokoferol dalam ekstrak
tempe. Sintesis dan Identifikasi Dimer d-tokoferol dilakukan dengan cara 50 mg d-tokoferol murni dilarutkan dalam 2,5 ml petroleum eter. Larutan ini
ditambah dengan 1ml larutan NaOH 0,2 M yang mengandung garam K3Fe(CN)6
0,1 g. Campuran diaduk dengan pengaduk magnet selama 45 menit dan suhu 45 oC.
Fasa air diekstraksi dengan petroleum eter 3 kali. Seluruh fasa organik
(petroleum eter) dikumpulkan, dibilas dengan akuades 5 kali kemudian
dikeringkan dengan Natrium sulfat. Ekstrak dievaporasi dengan suhu 20 oC
dalam tekanan rendah. Hasil yang diperoleh diidentifikasi dengan KLT. Dimer d-tokoferol hasil sintesis seperti yang
disebutkan dalam metodologi dikarakterisasi secara kualitaif dengan TLC
preparatif menggunakan pelarut campuran sikloheksana/eter (9:1). Waktu retensi
(Rf) dimer d-tokoferol dalam pelarut tersebut 0,58.
Waktu retensi dalam proses kromatografi dengan pelarut spesifik merupakan data
kualitatif untuk mengetahui keberadaan suatu senyawa. Senyawa dimer d-tokoferol dianalisis spektrofotometer UV,
Fluorosensi dan IR.
n Pemisahan senyawaan golongan antosianin dalam ekstrak buah blueberry,
ketela ungu atau anggur
n Pemisahan senyawaan golongan flovonoid, katekin, saponin dll
n Jika sampel berupa ekstrak dari tanaman, maka harus dicari dahulu fasa
gerak terbaik yang mampu memisahkan dengan baik
n Pemisahan senyawa aktif dalam obat misalnya Asetaminofen dengan
menggunakan fase diam silika gel dan fase gerak heksan:aseton (75:25) dengan
menggunakan deteksi UV.
2.8 Keuntungan Penggunaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Beberapa keuntungan dari kromatografi lapis tipis yaitu:
a.
Identifikasi
pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi atau
dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet
b.
KLT
banyak digunakan untuk tujuan analisis
c.
Dapat
dilakukan elusi secara menaik(ascending), menurun(descending), atau dengan cara
elusi dua dimensi
d.
Ketepatan
penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan
bercak yang tidak bergerak.
BAB III
PENUTUP
3.1
Kesimpulan
Berdasarkan pembahasan yang telah dipaparkan ditarik kesimpulan
bahwa Kromatografi
lapis-tipis merupakan
salah satu kromatografi yang berdasarkan adsorpsi. Prinsip kerjanya memisahkan
sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang
digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin
dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen
maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.
Pelaksanaan dan proses pemisahan dalam kromatografi lapis kertas meliputi penotolan sampel, pengembangan, deteksi bercak, dan penghitungan nilai Rf .KLT bisa digunakan untuk analisis kualitatif, kuantitatif, dan preparatif.
DAFTAR PUSTAKA
Clark,Jim.2007. Kromatografi
Lapis Tipis. http://www.chemistry.org/ diakses tanggal 19 Juni 2011
Khopkar. 2008. Konsep
Dasar Kimia Analitik. Jakarta:UI Press
Rohman,
Abdul.2010. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:Pustaka Pelajar
Underwood.
1999. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga
0 komentar:
Posting Komentar