BAB I
PENDAHULUAN
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas
pebedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase,
yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas). Analisis
dengan kromatografi dapat digunakan untuk analisis kualitatif &
kuantitatif. Sekarang ini, kromatografi sangat
diperlukan dalam kefarmasian dalam memisahkan suatu campuran senyawa. Dalam
kromatografi, koponen-komponen terdistribusi dala dua fase. Salah satu fase
adalah fase diam. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam
terjadi bila molekul-molekul campuran serap pada permukaan partikel-partikel
atau terserap di dalam pori-pori partikel atau terbagi kedalam sejumlah cairan
yang terikat pada permukaan atau didalam pori. Kromatografi dibagi menjadi beberapa macam, antara lain
: kromatografi eksklusi, HPLC ( High Performance Liquid Chromatography), GC
(Gas Chromatography) dan Elektroforesis. dalam makalah ini akan dijelaskan
beberapa keterangan tentang kroatografi eksklusi.
Kromatografi
eksklusi pada dasarnya adalah ragam kromatografi yang paling mudah dipahami dan
dilaksanakan. Cara ini dikenal dengan banyak nama (permeasi gel filtrasi gel,
eksklusi, pengayakan molekul, eksklusi ruang, dan sebagainya), dan dapat
dipakai untuk berbagai jenis senyawa yang berbobot molekul tinggi dan rendah.
Cara ini telah dipakai secara populer untuk memfraksinasi polimer, tetapi makin
sering dipakai untuk memisahkan molekul kecil. Cara ini, diantara semua cara KC
yang lainnya, unik karena didasarkan pada pembatasan fisik linarut yang masuk
ke dan keluar dari pori kemasan kolom. Antaraksi, seperti penyerapan pertukaran
ion, dan partisi, tidak ada dalam sistem eksklusi-ruang yang ideal
BAB II
PEMBAHASAN
KROMATOGRAFI EKSKLUSI
Kromatografi eksklusi pada dasarnya adalah ragam kromatografi yang paling mudah dipahami dan dilaksanakan. Cara ini dikenal dengan banyak nama (permeasi gel filtrasi gel, eksklusi, pengayakan molekul, eksklusi ruang, dan sebagainya), dan dapat dipakai untuk berbagai jenis senyawa yang berbobot molekul tinggi dan rendah. Cara ini telah dipakai secara populer untuk memfraksinasi polimer, tetapi makin sering dipakai untuk memisahkan molekul kecil. Cara ini, diantara semua cara KC yang lainnya, unik karena didasarkan pada pembatasan fisik linarut yang masuk ke dan keluar dari pori kemasan kolom. Antaraksi, seperti penyerapan pertukaran ion, dan partisi, tidak ada dalam sistem eksklusi-ruang yang ideal.[1]
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.[2] Kromatografi gel merupakan metode kromatografi baru, meliputi kromatografi eksklusi, kromatogeafi penyaring gel, dan kromatografi permeasi gel. Kromatografi ini paling mudah dimengerti dan paling mudah dikerjakan. Teknik permeasi gel adalah suatu teknik yang menguraikan campuran zat-zat sesuai dengan ukuran molekulnya. Teknik ini didasari atas inklusi dan eksklusi suatu zat terlarut melalui suatu fase diam yang terbuat dari gel polimer yang terikat silang ddan berpori heterogen. Dalam kromatografi eksklusi cair-padat pemisahan teradi antara vase cair di dalam partike gel dan cairan di luar mengelilingi partikel gel. Selain kesederhanaannya, teknik ini sangat berguna. Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang menggenang (stagnat mobile phase). Molekul-molekul yang lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silica atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam molekul solut yang mempunyai BM jauh kebih besar akan terelusi lebih dahulu kemudian molekul-molekul yang berukuran medium dan terakhir adalah molekul yang berukuran jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
Pada kromatografi eksklusi, fase
gerak tidak berpengaruh dalam kromatografi sehingga pelarut yang berlainan yang
mempunyai daya mensolvatasi yang sama menghasilkan hasil yang sama. Sedikit
banyak fase gerak pada kromatografi gas dalam fungsinya yang hanya sebagai
medium netral yang memungkinkan molekul solut memasuki fase diam.
A.
Kolom
Kolom
eksklusi mengandung partikel berpori dengan garis tengah pori yang berbeda.
Solut yang disuntikkan ke dalam kolom akan berdifusi ke dalam pori yang garis
tengahnya lebih besar daripada garis tengah efektif solut. Walaupun bobot
molekul sama, garis tengah efektifnya yang paling besar terelusi lebih dahulu.
Selain itu, garis tengah efektif
mencakup pula molekul solvasi apa saja.[3]
Dengan
bertambah besarnya garis tengah efektif solut, jumlah pori yang dapat
dimasukinya dan kemampuannya berdifusi ke dalam pori menurun. Jadi, jika solut
bergaris tengah demikian rupa sehingga tidak dapat berdifusi ke dalam pori yang
manapun, maka solut tersebut dapat dikatakan dieksklusi sempurna dan tidak
ditahan, artinya solut itu terelusi dalam volum mati (V0) kolom.
Solut yang mampu berdifusi sempurna ke dalam semua pori dikatakan berpermeasi
sempurna ke dalam kemasan. Solut jenis ini memerlukan volum pelarut yang jauh
lebih besar untuk mengelusinya dari kolom. Pemisahan komponen dapat tercapai
jika komponen itu terelusi dengan volum tambat antara V0 dan volum
permeasi total.[4]
Sebagai
penunjang fase diam dalam pemisahan ini biasanya digunakan xerogel-xerogel.
Xerogel adalah suatu gel organik yang dapat bersifat hidrofilik (yaitu : agar
dan dekstran yang terikat silang pada poliakrilamida) ataupun hidrofobik
(polistirena). Xerogel-xerogel ini tersedia di pasaran dengan nama dagang
biogel p-2 (poliakrilamida),sepadex G-10-200 (dekstran) juga styrogel (gel
polistirena yang dimodifikasi) dan agarose.
Kolom
yang digunakan adalah kolom biaya pengelusi (luent) dibiarkan mengalir karena
gravitasinya. Laju aliran akan bertambah dengan bertambahnya ukuran partikel
seperti kromatografi pertukaran ion, laju aliran juga dapat dipengaruhi oleh
variasi porositas gel. Untuk suatu gel yang tidak padat, volume interstisi
dapat diturukan dengan pemberian tekanan, volume eluent berkisar antara 25 –
100 ml. Seperti juga metode kromatografi lainnya, konsekuensi efluennya diukur
melalui sifat-sifat fisik yang sesuai. Seperti indeks refraksi, absorbansi,
intensitas pendarflour atau sifat-sifat listriknya.
Kemasan
untuk kromatografi eksklusi dapat dikelompokkan menjadi tiga golongan: setengah
kaku, kaku dan lunak :[5]
(a) Gel
Setengah Kaku
Bahan
ini menjadi sangat populer, umumnya diturunkan dari polimernya yang telah
disambung silangdengan berbagai presentase divinilbenzena untuk memperoleh
struktur yang setengah kaku. Bahan ini biasanya dipakai dalm pelarut organik, seperti
tetrahidrofuran, aseton, dan sebagainya, karena larutan dalam air tidak
membasahi permukaan manik polistirena. Kemasan ini, contohnya gel Styragel dan
gel TSK, menjadi sangat populer untuk memisahkan cuplikan polimer rumit,
seeprti karet dan plastik. Kekurangan utama kemasan partikel besar ini (dp = 37-75 µm) adalah alih massanya yang
rendah. Untuk memperoleh pemisahan yang memadai, harus dipakai laju aliran yang
rendah dan ini mengakibatkan waktu analisis yang panjang.
(b) Gel Kaku
Kemasan ini hampir selalu dibuat dari kaca atau silika. Kolom ini dapat dibeli dalam berbagai ukuran pori dan dalam bentuk partikel bergaris tengah kecil atau besar. Kemasan ini mempunyai keuntungan: kekuatannya menghilangkan pembatasan laju aliran karena dapat dipakai pada tekanan tinggi. Kolom yang sangat efisien mudah dibuat. Cara kemas lumpuran dapat dipakai. Beberapa pembatasan pada pelarut organik dapat dipakai dan penggantiannya cepat. Harus diperhatikan bahwa larutan basa dengan pH > 7,5 harus dihindari karena larutan itu dapat melarutkan silika dan kaca. Kekurangan utama kemasan ini ialah pengaruh penyerap yang sering menyulitkan.
Bahan polar sering terserap kuat dan pembentukan ekor dapat menimbulkan masalah. Penyerapan akan mengubah kurva kalibrasi, menyebabkan molekul besar keluar pada volume elusi yang sesuai dengan volume untuk senyawa bermolekul kecil. Kebanyakan pabrik menawarkan kemasan yang diawaaktfikan, tetapi penyerapan masih tetap dapat menimbulkan masalah gawat untuk senyawa sangat polar, seperti protein.
Pengaruh
penyerapan dapat diperkecil dengan berbagai pendekatan. Manik dapat
diperlakukan dengan Cabowax 400 atau polietilena glikol dengan cara yang sama
seperti pada pembuatan kemasan kromatografi gas. Selain itu, manik dapat
diperlakukan dengan berbagai pereaksi sililasi untuk mengawaaktifkan
titik-titik polar.
(c) Gel
Lunak
Contoh bahan ini ialah dekstran sambung silang, dan bahan yang paling populer ialah Sephadex. Kemasan gel lunak menggembung dalma pelarut yang dipakai (biasannya air) karena itu kita harus ‘merendamnya’ di dalam pelarut yang sekurang-kurangnya semalam sehingga tidak akan terjadi perubahan volum selama dipakai. Pemakaian babhan ini disebut filtrasi gel, tetapi mekannisme eksklusinya tetap sama. Gel ini berguna untuk memisahkan senyawa yang larut dalam air, yang rentang bobot molekulnya 102 – 2,5 × 107 ; sifatnya yang khas adalah rentang ukuran porinya yang lebar. Karena gel lunak terutama berguna untuk memisahkan polimer yang latrut dalam air, gel banyak dipakai dalam pencirian protein dan enzim. Gel lunak tidak dipakai dalam KCKT karena sangat rapuh dan tidak dapat menahan tekanan lebih dari 150 psi. Kekurangan lainnya ialah bahwa bahan ini dapat diuraikan oleh bakteri yang dapat menyebabkan hilangnya kinerja kolom.
Pemisahan suatu tipe gel bergantung pada ukurran molekul dan sifat kimia dari zat yang akan dipisahkan. Misalkan biogel 0 – 10 digunakan untuk zat-zat dengan berat molekul berkisar antara 500-17000 satuan. Molekul dengan besar molekul diatas batas ini yaitu limit eksklusif, akan lewat saja tanpa rintangan dari gel. Di bawah limit eksklusi, zat tersebut akan terelusi pada volume elusi yang sesuai dengan volume bed total. Untuk bekerja dalam medium tidak berair, gel yang tepat digunakan adalah sephadex LH-20. Pemakaian Kromatografi permeasi gel digunakan untuk analisis campuran molekul dengan berat molekul yang berbeda seperti pemisahan rafinosa, maltose, dengan menggunakan sephadex pada pH 7,0, laju aliran 5 ml/jam ddan H2O sebagai eluent. Pemisahan molekul- molekul dengan berat molekul sama dapat juga dilakukan dengan pemilihan yang tepat tipe gel dan tinggi kolomnya. Pengeluaran garam (desalting) adalah salah satu pemisahan yang meliputi pembebasan garam dan senyawa berberat dengan molekul makro.
Jika ukuran pori gel adalah 200-1000 maka hanya molekul yang berukuran antara 200-1000 saja yang akan ditahan oleh pori gel. Molekul dengan ukuran diatas 1000 adalah yang paling cepat keluar kolom karena tidak dapat masuk pori. Molekul dengan ukuran di bawah 200 akan masuk pori namun tidak ditahan karena ukurannya terlalu kecil dan akan keluar dari kolom berikutna. Molekul yang tertahan adalah molekul yang berhasil dipisahkan dan dielusi kembali untuk dianalisis.
Pemisahan fraksi-fraksi protein dari suatu sampel biologi
dapat menggunakan kolom Sephadex G-I00
berdiameter 6 cm dan panjang 185 cm. Protein merupakan senyawa kompleks dengan berat molekul cukup besar.
Penggelompokan protein dalam rentang berat molekul tertentu akan mempermudah
identifikasi selanjutnya. Elusi dengan penyangga berair menghasilkan pemisahan
berdasarkan ukuran molekul.
B.
Fase Gerak
Pemilihan pelarut pada kromatografi eksklusi bertujuan untuk meminimumkan interaksi antara solut dengan permukaan penyangga karena interaksi apapun dengan permukaan tidak diinginkan. Persyaratan pelarut pada kromatografi eksklusi adalah memiliki kemurnian yang tinggi, tidak bereaksi dengan fase diam, dapat bercampur dengan komponen sistem, pelarutnya baik untuk cuplikan, mampu ‘membasahi’ permmukaan kemasan dan viskositasnya rendah. Jika persyaratan di atas terpenuhi, maka solut dapat berpermeasi ke pori dengan proses difusi sepenuhnya. Untuk gel lunak, pelarut harus menggembungkan gel karena keporian (porositas) dipengaruhi oleh jumlah pelarut yang mandek. Untuk gel dekstran yang sering dijumpai, pelarut yang paling utama adalah air.[6]
Namun banyak dari pelarut yang
berguna dalam kromatografi eksklusi tidak sesuai dengan detektor UV berkepekaan
tinggi yang biasa digunakan pada ragam kromatografi cair lainnya. Toluena, tetrahidrofuran,
dan pelarut aromatik-terhalogenasi banyak dipakai karena semuanya mempunyai
sifat melarutkan yang sangat baik untuk senyawa berbobot molekul besar yang
yang biasa dianalisis dengan eksklusi. Hanya tetrahidrofuran (THF) yang dapat
digunakan dengan pendeteksian UV pada 254 nm. Akan tetapi, beberapa tingkat
mutu THF distabilkan dengan butil hidroksitoluena (BHT) atau hidrokuinon untuk
mencegah pembentukan peroksida yang dapat meledak. Senyawa penstabil itu dapat
dihilangkan dengan penyulingan secara hati-hati. Destilat yang diperoleh harus
disimpan dalam ruang gelap dan wadahnya diisi gas nitrogen.[7]
C.
Mekanisme Pemisahan
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.[8]
Kolom dapat
melewatkan molekul pelarut yang merupakan fasa bergerak, sedangkan molekul
polimer yang lebih kecil dapat memasuki pori – pori gel, karena itu bergerak
lebih lambat disepanjang kolom dibanding molekul besar. Elemen yang keluar
dideteksi dengan cara spektroskopi atau cara – cara fisik lainnya dan
dikalibrasi dengan larutan polimer standar untuk menghasilkan kurva distribusi
bobot molekul.
D.
Penggunaan Kromatografi Eksklusi Gel
Metode ini dapat digunakan terhadap suatu cuplikan yang larut dan penggunaan utama kromatografi gel biasanya dalam salah satu dari tiga hal ini. Pertama, kromatografi gel sangat berguna untuk pemisahan spesies dengan berat molekul tinggi (BM>2000), terutama yang tak terionkan. Selain dari resolusi dari setiap makromolekuler seperti protein dan asam nukleat, kromatografi gel dapat digunakan untuk mendapatkan distribusi berat molekul dari polimer sintetis. Kedua, campuran sederhana dapat dipisahkan secara mudah dengan kromatografi gel, terutama jika penyusun campuran itu memiliki berat molekul yang sangat berbeda. Untuk hal ini dapat dilakukan dalam jumlah besar. Ketiga, kromatografi gel sangat cocok untuk kerja awal, pemisahan eksplorasi dari cuplikan yang tak diketahui. Pemisahan ini memberikan gambaran isi cuplikan, sehingga dapat diketahui dengan cepat apakah cuplikan itu memiliki berat molekul rendah atau berat molekul tinggi.
Metode ini didasarkan pada teknik fraksinasi yang tergantung dari ukuran molekul polimer yang diinjeksikan ke dalam suatu kolom yang terdiri atas gel berpori berjari – jari sekitar 50 – 1060 A.
BAB III
PENUTUP
Kromatografi
eksklusi pada dasarnya adalah ragam kromatografi yang paling mudah dipahami dan
dilaksanakan. Kromatografi ini disebut
juga dengan kromatografi permiasi gel dan
dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat
molekul > 2000 dalton. Teknik
permeasi gel adalah suatu teknik yang menguraikan campuran zat-zat sesuai
dengan ukuran molekulnya. Teknik ini didasari atas inklusi dan eksklusi suatu
zat terlarut melalui suatu fase diam yang terbuat dari gel polimer yang terikat
silang ddan berpori heterogen.
Fase diam yang
digunakan dapat berupa silica atau polimer yang bersifat porus sehingga solut
dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam
molekul solut yang mempunyai BM jauh kebih besar akan terelusi lebih dahulu
kemudian molekul-molekul yang berukuran medium dan terakhir adalah molekul yang
berukuran jauh lebih kecil. Kemasan untuk kromatografi eksklusi dapat
dikelompokkan menjadi tiga golongan: gel setengah kaku, gel kaku dan gel lunak.
Pada kromatografi eksklusi, fase gerak tidak berpengaruh dalam kromatografi sehingga pelarut yang berlainan yang mempunyai daya mensolvatasi yang sama menghasilkan hasil yang sama. Sedikit banyak fase gerak pada kromatografi gas dalam fungsinya yang hanya sebagai medium netral yang memungkinkan molekul solut memasuki fase diam.
DAFTAR PUSTAKA
Johnson, Edward L. dan Stevenson,Robert. 1991. Dasar
Kromatografi Cair. Bandung : Penerbit ITB.
Gandjar, Ibnu Gholib dan Rohman, Abdul. 2007. Kimia Farmasi.
Yogyakarta: Pustaka Pelajar.
Khopkar,
S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press.
http://niellastory.wordpress.com/analisis/
[1] Edward L. Johnson dan Robert Stevenson, Dasar Kromatografi Cair, (Bandung, Penerbit ITB, 1991), hal 153.
[2] Ibnu Gholib Gandjar dan Abdul Rohman, Kimia Farmasi, (Yogyakarta, Pustaka Pelajar, 2007), hal 399.
[3] S.M.
Khopkar, Konsep Dasar Kimia Analitik, (Jakarta, UI Press, 1990), hal
167.
[4] S.M. Khopkar, Konsep Dasar Kimia Analitik, (Jakarta, UI Press, 1990), hal 167.
[5] Edward L. Johnson dan Robert Stevenson, Dasar Kromatografi Cair, (Bandung, Penerbit ITB, 1991), hal 157-161.
[6] Edward L. Johnson dan Robert Stevenson, Dasar Kromatografi Cair, (Bandung, Penerbit ITB, 1991), hal 163
[7] Ibid, hal 163
[8] Ibid, hal 399.
0 komentar:
Posting Komentar